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蛋白表達 實驗的時候，有時候實驗會覺得參考實驗方法和克隆的蛋白基因序列完全沒有問題，蛋白電泳就是沒有結果。遠慕生物為大家總結和一些網(wǎng)絡資源匯總了下蛋白不表達的原因。
1.載體 構建錯誤。這個屢見不鮮，很多克隆新人經(jīng)常弄錯讀碼框。比如Qiagen的pQE系列載體，其克隆位點常有一兩個堿基的區(qū)別;另外有些酶產(chǎn)生粘端有些酶產(chǎn)生平端，這些都容易導致讀碼框錯誤，從而表達不出來。
2.宿主菌選擇不當。不同的宿主菌其基因型是不一樣的。有些經(jīng)過特殊修飾的載體 ，或者特殊用途的載體，或者有特殊啟動子的載體，必須選擇合適的宿主菌進行表達。因此，當你的蛋白沒有表達出來時，可以考慮更換宿主菌。
3.密碼子的使用頻率低。有些基因其本身含有許多稀有密碼子，尤其是起始密碼之后的15個堿基之內的稀有密碼子，對蛋白表達有著很重要的影響。優(yōu)化密碼子對原核表達似乎效果很好，對真核表達系統(tǒng)未見得有很好的效果。
曾經(jīng)有某人在畢赤酵母表達某蛋白兩年未果，試圖將密碼子優(yōu)化進行表達，結果還是沒有表達。一氣之下將該優(yōu)化的基因序列克隆到原核表達載體 ，表達量居然出奇地高!這是一個辛酸的笑話，但是一個真實的故事。
但是有一點我可以有很大把握的說：對于真核表達，密碼子優(yōu)化只能起錦上添花的作用（確認有表達，以此來提高表達量），而不能雪中送炭（沒有表達出來，通過密碼子優(yōu)化有可能不奏效）。
4、質粒不穩(wěn)定或者質粒丟失。pET系統(tǒng)通常比較穩(wěn)定。但是你選用帶氨芐青霉素抗性的載體時，也許有可能產(chǎn)生β-lactamase降解了抗生素，使質粒丟失。還有一種情況是表達重組 的毒素蛋白，對宿主細胞也有毒性，造成質粒丟失。這種情況多見于真核表達系統(tǒng)。
5、蛋白酶將蛋白降解了。這種情況常由重組蛋白本身的N-或C-端序列引起的。當?shù)鞍譔-端是Arg, Leu, Lys, Phe, Trp,或 Tyr這些氨基酸時，容易遭受蛋白酶降解，此即N-末端規(guī)則。
N-端是Met時，大腸桿菌可以悄悄地把這個Met偷走，特別是Met后緊跟著一個帶小側鏈的氨基酸時。C-末端存在非性氨基酸時，也容易導致蛋白被降解。C末端后5個氨基酸是性的或者帶電荷的，則不易被降解。
6、二翻譯起始位點。這種情況見于你的序列里正好含有和核糖體結合位點完全一致的序列。那就怪不得人家了，核糖體會很高興地找到這個位點，然后開始翻譯，致使你的蛋白被截短，在電泳時看不到預期大小的片段。
7、SD序列。這個不陌生吧?考研時老師喜歡出名詞解釋，也難怪人家老是拿這個出題－－－－SD序列和起始密碼子序列（80%是AUG，也有GUG的）之間的距離，對蛋白表達的效率也有著非常重要的影響。SD序列本身的組成對翻譯效率也有影響。有時為了減少包涵體的產(chǎn)生，還特別對SD序列進行修飾呢!
8、 mRNA的二結構。在克隆之，你得看看你的序列里是否有和核糖體結合位點和/或翻譯起始位點互補的序列。如然，你好進行同義密碼子替換。否則由此形成的mRNA二結構，會讓翻譯嘎然而止的。
9、意外終止。這種情況見于PCR擴增序列時，會和你開個不大不小的玩笑。比如它會將序列中間TAC突變?yōu)門AA，讓你的蛋白翻譯剎車。所以在進行表達之，一定要進行測序，避免這種情況的發(fā)生。
10、轉錄終止子。轉錄終止子的存在可以促進蛋白表達;但是缺少時就會造成“通讀”，沒完沒了地讀下去。這在pET系統(tǒng)里不成問題，因為它在靶基因的相反方向有個選擇性的標記基因。如果你的靶基因正好和這個標記基因方向一致，那么你得看看你的靶基因后是否有個轉錄終止子。如果沒有的話，它們會競爭得天昏地暗，著生成mRNA和蛋白質。
11、 mRNA的不穩(wěn)定性。靶基因的mRNA常聚集于細胞內。但是大腸菌的mRNA及其不穩(wěn)定。如果在mRNA的5＇-非翻譯區(qū)和3‘-rho非依賴性終止子處插入穩(wěn)定結構序列，可以促進mRNA的穩(wěn)定性。尤其是5＇末端要是有個不帶突出的發(fā)夾結構，能讓mRNA在胞漿內無生命之虞。
12、檢測方法的可行性。有時候，蛋白的確表達了，只是表達量特別低，或者和雜帶靠得特別近，致使你錯誤地以為蛋白沒有表達。這時候，你可千萬別忘記了生物學實驗的兩大黃金準則：對照和重復。說到對照，有很多層意思�；镜囊馑际�，要設立空載體對照。
在真核系統(tǒng)表達的蛋白，常常量特別低。因此你不要老是想著WB和SDS-PAGE去檢測。這時候，你必須多看文獻，另辟蹊徑，從文獻中找找看這個蛋白有米有很特別的性質－－－－比如說如果它具有酶活性，那簡直就是便宜你了。
還比如說，某些蛋白具有異樣性質，比如說流感病毒的HA，你拿表達的不同梯度稀釋的蛋白做個血凝。如果發(fā)生血凝，并且呈現(xiàn)一定的梯度關系，那簡直就是板上釘釘?shù)氖虑榱恕?br />
總結起來，任何實驗實驗材料都相當重要，蛋白表達載體構建正確是蛋白表達實驗的基礎，因此務必要保證蛋白表達載體正確性，合適的宿主菌也是蛋白表達實驗的基礎。
客服一
